凋亡抑制蛋白基因dsRNA转基因烟草表达载体的构建

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摘 要 ：为了利用RNA干扰技术防治烟粉虱,需要构建凋亡抑制蛋白（IAP）基因dsRNA转基因烟草表达载体.利用PCR技术扩增烟粉虱IAP基因,将其连接到pMD18-T载体中,用BglⅡ、XhoⅠ和BamHⅠ、SalⅠ分别酶切,将获得的片段分别反向、正向连接至pUC-RNAi载体,用PstⅠ酶切pUC-RNAi-IAP,回收酶切片段,将其连接到表达载体pCAMBIA-2300-35S中,并进行酶切验证.IAP　dsRNA转基因烟草表达载体的成功构建为下一步转基因烟草防治烟粉虱的研究奠定基础.

关 键 词 ：凋亡抑制蛋白；dsRNA；转基因烟草；RNA干扰；烟粉虱

中图分类号：Q782文献标识码：ADOI编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2013.01.002

Construction　of　Transgenic　Tobacco　Plant　Vector　for　Inhibitor　of　Apoptosis　Protein　Gene　dsRNA

GUO　Qiang,　CHU　Dong,　FAN　Zhong-xue

（Shandong　Provincial　Key　Laboratory　of　Crop　Geic　Improvement,　Ecology　and　Physiology,　High-tech　Research　Center,　Shandong　Academy　of　Agricultural　Sciences,　Ji'nan,　Shandong　250100,China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：To　contol　Bemisia　tabaci　by　RNAi,　transgenic　tobacco　plant　vector　for　inhibitor　of　apoptosis　protein　（IAP）　gene　dsRNA　should　be　constructed.　In　this　study,　we　amplified　the　IAP　gene　of　Bemisia　tabaci　by　PCR,　inserted　it　into　pMD18-T,　digested　with　BglII/XhoI　or　BamHI/SalI　respectively,　conducted　the　acquired　fragments　to　pUC-RNAi　vector,　digested　with　PstI,　and　cloned　into　the　vector　pCAMBIA-2300-35S.　Transgenic　tobacco　plant　vector　was　confirmed　by　PstI　digesting.　The　construction　of　transgenic　tobacco　plant　vector　for　IAP　dsRNA　would　lay　the　foundation　for　the　following　study　of　pest　control.

Key　words：　inhibitor　of　apoptosis　protein；　dsRNA；　transgenic　tobacco　plant；　RNA　interference；　Bemisia　tabaci

烟粉虱Bemisia　tabaci（Gennadius）广泛分布于全球除南极洲外的各大洲,是热带、亚热带及相邻温带地区棉花、蔬菜和园林花卉等植物及大田作物的主要害虫之一[1].它不仅取食寄主植物汁液,而且能够传播100多种病毒,分泌大量蜜露诱发煤污病影响光合作用[2-3].烟粉虱也是科技界有史以来唯一被冠以“超级害虫”（superbug）的昆虫,近20年来给许多国家的农业造成严重的经济损失.烟粉虱在我国广大地区已暴发成灾并造成严重危害,近年来烟粉虱传播的双生病毒在山东、浙江、江苏等地区给番茄等蔬菜造成毁灭性的危害[4].现在控制烟粉虱的主要手段为化学防治.化学农药的大量使用,不仅导致农药残留,破坏了环境与生态系统平衡,而且导致烟粉虱抗药性逐年增强.目前,传统的烟粉虱防治策略难以满足农业生产的需要,急需新的防控手段.

RNA干扰（RNA　interference,RNAi）是由与靶基因序列同源的双链RNA（dsRNA）介导的特异性基因表达沉默现象,是生物的一种古老并且进化上高度保守的基因表达调节机制.Fire等[5]（1998）首次发现将dsRNA注入线虫Caenorhabditis　elegans可以导致同源基因的mRNA降解,从而导致转录后基因沉默,并将这种由dsRNA引发的抑制特定基因表达的现象称为RNAi.随后,RNAi的基础研究和应用研究迅速成为当前生命科学中的热点领域之一.例如,Zhu等[6]（2008）利用RNAi技术研究几丁质酶（Chitinase）样蛋白在赤拟谷盗Tribolium　castaneum中的功能,注射TcCHT5　dsRNA至幼虫,TcCHT5转录水平降低,使蛹不能完全羽化；RNAi沉默TcCHT10表达,可以阻止胚胎孵化、幼虫蜕皮和成虫蜕变,证明TcCHT10蛋白在昆虫发育过程中具有重要的作用.RNAi应用于农作物遗传改良进行精准抗虫已成为近年来研究的一个热点[7-8].Chen等[9]（2008）注射合成的dsRNA/siRNA到甜菜夜蛾Spodoptera　exigua的四龄幼虫诱导几丁质合成酶（chitin　synthase　gene　A,CHSA）沉默,结果发现大多异常的幼虫不能蜕皮,或进入下一期的幼虫明显小于正常幼虫,并且气管上壁不能统一扩张,明显提高了异常发生率.这些研究提示了应用RNAi防治害虫的可能.

在前期研究中,我们发现凋亡抑制蛋白（Inhibitor　of　Apoptosis　Protein,IAP）的dsRNA能够导致烟粉虱死亡.IAP是指能够保护特定的细胞抵抗一系列刺激原诱导,从而避免细胞凋亡发生的一类蛋白,它是一类高度保守的抗凋亡基因家族表达产物.IAP结合并抑制caspase的活性,从而阻止细胞死亡,甚至可以调节细胞周期和信号转导[10-12].为了研究IAP基因的dsRNA诱导RNAi对烟粉虱的影响,利用RNAi防治烟粉虱,笔者构建了IAP　dsRNA转基因烟草表达载体. 1材料和方法

1.1材　料

1.1.1菌株和质粒　大肠杆菌Trans109、pMD18-T

载体购于TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司,pUC-RNAi载体和pCAMBIA-2300-35S表达载体由山东省农业科学院高新技术研究中心王兴军研究员提供.

1.1.2烟粉虱B型和Q型烟粉虱Bemisia　tabaci（Gennadius）由本项目组培养于人工气候箱中,在扶桑（Hibiscus　rosa-siensis）植株上维持种群,温度为（26±2）　°C,相对湿度为70%,光周期为L∶D等于16∶8.

1.1.3工具酶和主要试剂BamHⅠ、BglⅡ、PstⅠ、SalⅠ和XhoⅠ内切酶购于TaKaRa公司,DNA　Ligation　Kit、RNAisoTM　Plus、DL2000TM　DNA　Marker购于TaKaRa公司；RQ1　DNAase购于Promega公司；RevertAidTM　First　Strand　cDNA　Synthesis　Kit购于MBI　Fermentas公司；EasyTaq　DNA酶、EasyPureTM　Quick　Gel　Extraction　Kit、EasyPureTM　Plaid　MiniPrep　Kit购于北京全式金生物技术有限公司,dNTP购于上海生工生物工程有限公司；其他化学试剂均为AR级产品.

1.1.4主要试验仪器TaKaRa　PCR　Thermal　Cycler　Dice?誖PCR仪,Sigma　3K30高速低温离心机,Techp　CT14D高速离心机,AlphaImger　EP　Alpha　Innotech凝胶成像系统.

1.2方　法

1.2.1烟粉虱RNA的提取和cDNA的合成用RNAiso　Plus（TaKaRa）试剂提取烟粉虱总RNA,用RQ1　DNAase去除基因组污染,用MBI　Fermentas公司的反转录试剂盒（RevertAidTM　First　Strand　cDNA　Synthesis　Kit）反转录合成cDNA第一链.

1.2.2PCR扩增与检测　根据Leshkowitz等[13]附件1的IAP基因序列确定RNAi的靶序列,设计其PCR扩增引物：IAP　F　5’-　GAAGATCTTCGGCGATGTTCCTTGTTTAG-3’；IAP　R　5’-　CCGCTCGAGCGGACTGAGATGATTCCGAGA

C　-3’,上下游引物的5’端分别引入BglⅡ和XhoⅠ酶切位点（下划线）.

取2　μ　L　cDNA进行PCR扩增,体系为：引物20　μmol·L-1各0.5　μL,5　U·μL-1　Taq酶0.5　μL,10×Taq　Buffer5　μL,10　mmol·L-1　dNTP　1　μL,补ddH2O至总体积50　μL.扩增条件为：94　℃变性30　s,51.3　℃退火30　s,72　℃延伸35　s,共30个循环,72　℃延伸7　min,4　℃保温.

1.2.3表达载体的构建将IAP的PCR片段插入到pMD18-T载体中,用BglⅡ和XhoⅠ酶切获得大约441　bp左右的片段,将其反向连接至pUC-RNAi载体,再用BamHⅠ和SalⅠ酶切获得大约470　bp左右的片段,将其正向连接至pUC-RNAi载体,用PstⅠ酶切pUC-RNAi-IAP质粒,应切出1　132　bp左右的片段,回收酶切片段,将其插入用PstⅠ酶切的表达载体pCAMBIA-2300-35S中,并进行酶切验证.

2结果与分析

2.1IAP基因的克隆

用RNAiso　Plus（TaKaRa）试剂提取B型和Q型烟粉虱总RNA,用RQ1　DNAase去除基因组污染,用MBI　Fermentas公司的反转录试剂盒反转录合成cDNA第一链.用IAP引物进行PCR扩增,1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,结果表明,PCR扩增片段的大小与预期的一致,为452　bp左右（图1）.

将PCR扩增的IAP片段进行测序,去除酶切位点后与Leshkowitz等[14]报道的IAP序列用CLUSTAL　W软件进行比对,发现我们扩增的PCR片段与其报道的序列基本一致,只在第202位有点突变,并且B型和Q型烟粉虱的IAP序列完全一样（图2）.　因此,下面的试验用B型烟粉虱的IAP基因进行研究.

2.2中间载体pUC-RNAi-IAP的构建

为了表达IAP　dsRNA,设计了表达IAP　dsRNA的发夹结构（图3A）.将IAP的PCR片段插入到pMD18-T载体中,用BglⅡ和XhoⅠ酶切获得大约441　bp左右的片段,将其反向连接至pUC-RNAi载体,再用BamHⅠ和SalⅠ酶切获得大约470　bp左右的片段,将其正向连接至pUC-RNAi载体,用PstⅠ酶切鉴定,获得1　132　bp左右的片段（图3B）,与预期相符,说明中间载体pUC-RNAi-IAP构建成功.

2.3　表达载体pCAMBIA-2300-IAP的构建

用PstⅠ酶切中间载体pUC-RNAi-IAP,DNA凝胶回收试剂盒回收纯化1　132　bp左右的片段,将其插入用PstⅠ酶切的表达载体pCAMBIA-2300-35S中,获得表达载体pCAMBIA-2300-IAP（图4A）,用PstⅠ酶切鉴定（图4B）,获得片段大小相符,说明表达载体pCAMBIA-2300-IAP构建成功.

3讨　论

烟粉虱至少可以分为24个生物型[15],其中B型和Q型已侵入许多国家和地区.B型烟粉虱自20世纪90年代末传入我国并且造成了严重危害.Q型烟粉虱在2003年首先在云南被发现[16],现已扩散到我国东部、中部和南部大部分地区[17],并已成为优势生物型[18-20],并且对新烟碱类和吡丙醚等农药有较高的耐药性[21-22],因此需要探索新的防治烟粉虱的策略. 通过饲喂转基因植物诱导RNAi,用于防治害虫已在鳞翅目和鞘翅目昆虫中试验成功[8,　23].例如,Mao等[24]研究发现表达P450基因（CYP6AE14）和谷胱甘肽基因GST1　dsRNA的棉花对取食的棉铃虫Helicoverpa　armigera（Hubner）幼虫诱导了RNAi,阻碍了幼虫的发育,这一技术为防治农作物害虫提供了新的策略.Baum等[25]鉴定了玉米根萤叶甲Diabrotica　virgifera　virgifera（Le　Conte）290个生长发育相关基因,利用RNAi饲喂该虫幼虫的方法筛选出14个在低dsRNA浓度对昆虫具有致害效应的基因.例如,表达V型ATP酶A基因dsRNA的转基因玉米受到玉米根萤叶甲的损害与对照组相比明显降低；在摄食24　h内快速下调内源性mRNA,诱发特异性RNAi反应；编码V型ATP酶亚单位和β-微管蛋白的dsRNA能够使昆虫产生系统性基因沉默.这些研究结果表明,RNAi在农作物遗传改良进行精准抗虫方面具有重大的应用前景.RNAi应用于农作物抗害虫具有以下优点：（1）抗害虫的高效性；（2）抗害虫兼顾特异性与广谱性,转基因植物表达害虫重要基因的dsRNA,基于dsRNA的特异性程度,可获得对一种或几种害虫的抗性,而不影响其他昆虫；（3）因为RNAi植物表达的是dsRNA和siRNA而不是蛋白质,所以易于在农作物中推广.作为植物调节生长发育和保持遗传稳定性的重要机制,植物内源的dsRNA和siRNA大量存在,因此表达了与植物自身无同源序列的dsRNA,不会对寄主植物产生不良的影响,也更容易被接受.

在本研究中,笔者构建了IAP　dsRNA转基因烟草表达载体pCAMBIA-2300-IAP,通过将其用于烟草转基因,将进一步研究IAP基因的dsRNA诱导RNAi对烟粉虱的影响,探索利用RNAi技术防治烟粉虱.

致谢：感谢山东省农业科学院高新技术研究中心王兴军研究员提供pUC-RNAi载体和pCAMBIA-2300-35S表达载体；感谢山东省农业科学院高新技术研究中心夏晗博士在载体构建方面的指导.

本论文为生物工程方面有关论文的致谢,关于凋亡抑制蛋白基因dsRNA转基因烟草表达载体的构建相关毕业论文格式，可用于生物工程论文写作研究的大学硕士与本科毕业论文开题报告范文和优秀学术职称论文参考文献资料下载。免费教你怎么写生物工程及载体及基因方面论文范文。

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